天主教博物館位于大三巴牌坊后，于１９９６年１０月對外開放。博物館建于數百年前被燒毀的圣保祿教堂原址，現存的大三巴牌坊就是圣保祿教堂的前門外壁。 博物館展室在地下層，陳列多件宗教藝術品，表現澳門豐富的傳教歷史。收藏的展品中有圖畫、雕刻、及禮儀裝飾品等，這些有代表性的展品，都是從澳門所有的教堂的修院的收藏品中精挑細選出來的。它們都是十六至十九世紀的作品，屬本地教會所有，并由教會捐獻給博物館珍藏。 博物館內有一長方形玻璃展柜把展館分為內外兩部分，人們可沿兩條路線欣賞展品。在展館的內側，值得一提的有：一個罕有的十七世紀印葡作品木制圣彌額爾大天神；一座十七世紀木制的，面容純潔無邪的無原罪圣母像；象牙制的小雕塑澳門的庇護使者圣約翰洗者，以及澳門第一座教堂的守護神??圣安多尼。此外，還有一些大型雕像及油畫。 博物館的隔壁為墓室??小堂，建于當時天主之母學院主教堂的地點，存放有日本和越南殉教者的遺骨以示尊重。從小陽臺進入墓室參觀后，便進入神圣殿堂，此時應該保持肅靜。如果體驗此處的宗教氣息，可以仔細觀看一座刻在大理石上的祭壇，在這獨一無二的巨石上，豎立著一個十字架和一座圣體龕。